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组卵白提取

宣布者:艾美捷科技    宣布时辰:2021-06-08     
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组(zu)卵白有四品种(zhong)型(xing):H2A、H2B、H3、H4,组(zu)卵白是(shi)染色体根基(ji)布局(ju)卵白,因富含碱性(xing)(xing)(xing)氨基(ji)酸(suan) Arg 和 Lys 而呈碱性(xing)(xing)(xing),可与酸(suan)性(xing)(xing)(xing)的 DNA 慎密连系。由于组(zu)卵白是(shi)偏(pian)碱性(xing)(xing)(xing)的,是(shi)以(yi)咱们能(neng)够利用酸(suan)法来提取。


尝(chang)试(shi)操纵(zong)步骤:


1、将 3-5×105 个细胞(bao)种(zhong)到 6 孔板中,接着(zhe)停止(zhi)本身须要(yao)的(de)尝试处置(zhi),处置(zhi)竣事后起头(tou)收卵(luan)白,先用 1×PBS 将细胞(bao)洗两次,每次吸尽(jin)上清(qing)。


2、每孔插手 200ul NETN 裂(lie)解(jie)液,冰上裂(lie)解(jie) 15min


High salt NETN buffer


母液

配制 100ML


20mM Tris,PH=8.0

1M

2ml


500mM NACL

5M

10ml


0.5% NP-40

20%

2.5ml


1mM EDTA

0.5M

200ul


H2O


85.3ML


临用前加卵(luan)白酶按捺剂





3、用细胞刮(gua)刮(gua)细胞,将细胞搜集于 1.5mlEP 管中,1500g,4℃,离心(xin) 10min


4、离心竣事后能(neng)够在管底看到一小团靠近通明的积淀,谨慎吸(xi)尽上(shang)清,用 1ML NETN buffer 洗积淀一次或(huo)两次,1500g,4℃,离心 10min


5、吸尽上清,谨慎(shen)吸,积(ji)淀轻易被吸走,插手(shou) 0.2M HCL 100ul (浓盐酸的浓度(du)为 12M)冰水裂解 30min,(30min 后(hou)积(ji)淀变(bian)成一个红色的小团块)


6、12000RPM,4℃,15min 离心,此时组卵白已消(xiao)融在上(shang)清中(zhong),将上(shang)清转移到新的(de) EP 管中(zhong),插手 20ul 的(de) 1M Tris ph=8.0 中(zhong)和酸性(5 倍体积的(de) HCL 加 1 倍体积的(de) 1M Tris PH=8.0, 如 100ul 的(de)上(shang)清中(zhong),可插手 20ul 的(de) 1M Tris。


若(ruo)中和不充(chong)实,则鄙人(ren)一步(bu)插手(shou) SDS 的时辰溶(rong)液会显现黄色(se)(se),可适当(dang)补(bu)加 1M Tris PH=8.0,只到溶(rong)液规复(fu)蓝色(se)(se))。


7、可用考马斯法测卵白浓度


8、用 SDS 煮卵(luan)白(bai),100℃,10min.。接上去可停止 Western blot 尝(chang)试(shi)。


9、跑胶时,上样量为 5ug 时比(bi)拟适合(he)。能够按照本身的详细尝试停(ting)止调剂。


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