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重组卵白质的抒发、纯化、复性和定量

宣布者:艾美捷科技    宣布时候:2021-06-08     
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按操纵手册停止,详细步(bu)骤(zhou)以下(xia)。


一、重组卵白质的引诱抒发


1.挑(tiao)取(qu)转(zhuan)化有质粒的单菌落(luo),接种(zhong)于 3ml 挑(tiao)选性(xing) LB 液体培育(yu)(yu)基(ji)中(zhong),37 oC,250rpm/min 振摇培育(yu)(yu)留宿。


2. 第二天将培育(yu)留宿(su)的菌(jun)液 500 μl 再接种(zhong)于 10 ml(1:::20)挑选(xuan)性 LB 液体培育(yu)基中,37 oC,250 rpm/min 振摇(yao)培育(yu)至光密度(OD600=0.6)时,取 1 ml 样本作为引诱前标本,10000g 离心 1 min 搜集菌(jun)体积淀,-20 oC 冻存(cun)备用。


3. 插手 1 mol/L IPTG 于(yu)菌(jun)液中,使 IPTG 终浓度为 1 mM,37 oC,250 rpm/min振摇培(pei)育 4~5 小(xiao)时(shi)。取 1 ml 样本作(zuo)为引(yin)诱后标本,同上法搜集(ji)菌(jun)体积淀,-20 oC 冻存备用。


4. 将引诱前后(hou)菌体积(ji)淀用 20 ~ 40 μl PBS(pH= 8.0)重悬,插手等体积(ji)的 2×SDS上样缓冲(chong)液,煮沸加热 5 min,SDS 聚(ju)丙烯(xi)酰胺凝胶(SDS-PAGE)电(dian)泳(yong)分手 ,考马斯(si)亮蓝染色 3 小时(shi)后(hou),脱色察看(kan)成(cheng)果。


5. 拔取引(yin)(yin)诱胜利的细菌克隆,扩展引(yin)(yin)诱范围,搜集菌体积淀,于-20 oC 保 存(cun) ,筹办做下一步阐(chan)发(fa)及纯化。


二、重组卵白质的分手纯化


重组卵白质的可溶性判定

1.将(jiang)按(an)上法引诱培育后(hou)搜集(ji)的菌(jun)体重悬于裂解液 1 (Lysis buffer under nativeconditions )中,而后(hou)在(zai)-80 oC 高温冰(bing)箱中安排 10 min。


2. 冰中冻结。


3. 在冰浴上用超声破裂仪破菌 6 次,每次 10 sec,间歇 10 sec,电压 200-300 V。


4. 10000g,4oC,离心 20 min,取上清(为溶液 A), -20 oC 保管;另将积淀用一样裂解液 1 消融(为溶液 B),一样-20 oC 保管,供后继阐发利用。


5. 将上(shang)述 A、B 溶液(ye)和引诱前后(hou)的细菌停止 SDS-PAGE 电(dian)泳,考马斯亮蓝染色,比拟阐发重(zhong)组卵(luan)白(bai)(bai)(bai)质(zhi)的消融性(xing)。若是(shi)引诱抒发的卵(luan)白(bai)(bai)(bai)质(zhi)位于 A 溶液(ye)中,则为可(ke)溶性(xing)卵(luan)白(bai)(bai)(bai);若是(shi)是(shi)在(zai) B 溶液(ye)中,则为非(fei)可(ke)溶卵(luan)白(bai)(bai)(bai)。


重组卵白质为非可溶性卵白(变性前提下)的分手纯化

1.将菌体积淀溶于适当裂解液 2(Lysis buffer under denaturing conditions )中,室温下(xia)搅(jiao)拌和奏乐积淀,防止泡沫天(tian)生。


2. 10000g,4 oC,离心 30 min,搜集上清液。


3. 将 Ni-NTA Agarose 充填柱子,并毗连于 Pharmarcia 高压液相层析体系,用 5倍柱体积的裂解液 2 均衡 Ni-NTA Agarose,调理 A280 值至零线。


4.将适当上清液上样到 Ni-NTA Agarose 柱子中,并用 lysis buffer 冲刷至 A280值低于 0.01。


5. 别离用 5~10 倍柱体积的洗濯液 1 和洗濯液 2(Wash buffer 1 and 2)洗濯柱子,直至 A280 值低于 0.01。


6. 用洗脱液(Elution buffer)洗脱重组卵白质,在 A280 值监测下,搜集呈现峰线后含有重组卵白的一切洗脱液。


三、重组卵白质的复性、冻干和定量

纯化后的(de)(de)卵白(bai)用(yong)梯度下降(jiang)的(de)(de)尿素溶(rong)液迟缓透析,终(zhong)究用(yong) 0.01×PBS 透析,透析后的(de)(de)卵白(bai)质(zhi)溶(rong)液经冻干成粉状。以牛血(xue)洁白(bai)卵白(bai)(BSA)为(wei)规范,接(jie)纳 BIO-RAD 公司卵白(bai)质(zhi)定(ding)(ding)量试(shi)剂(ji)(protein assay)比色测(ce)定(ding)(ding)卵白(bai)质(zhi)的(de)(de)含量。




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